- 项目名称：
- 异氟烷对幼小鼠自主活动和学习记忆行为的影响
- 简介：
- 吸入麻醉药异氟烷对儿童认知功能的影响一直是研究热点。本实验以异氟烷为研究对象，结果显示异氟烷可降低幼小鼠自主活动次数，损害学习记忆能力，GABAA受体可能部分参与了以上作用。因此在临床患儿麻醉时，针对神经发育已经有异常的患儿，使用异氟烷麻醉诱导应慎重选择。该论文发表于《中国药理学与毒理学杂志》，2011年第25卷第3期
- 详细介绍：
- 异氟烷对幼小鼠自主活动和学习记忆行为的影响
张科学1，赵佳佳1，张庆华1，权全1，王晓健1，李华超1，林洁荣1，蔡慧明1， 刘苏1，戴体俊2*
（徐州医学院1．麻醉学院，2.麻醉药理学教研室，江苏 徐州 221002）
摘要：目的 观察异氟烷(Iso)对幼小鼠自主活动和学习记忆行为的影响，探讨其与GABAA受体的关系。方法 360只小鼠分为3大组，分别进行自...(查看更多)主活动实验、避暗实验和跳台实验，每大组按分层随机区组分为正常组，Iso 0.05、0.1和0.2 ml·kg-1组、GABAA受体特异性阻断剂一叶萩碱（Se）2、4和8 mg·kg-1组和Iso 0.2 ml·kg-1+Se 2、4和8 mg·kg-1组，测试前25min sc Se，10min后ip Iso。测试给药后15 ，30 ，45 和60 min小鼠5 min内活动次数；跳台仪和避暗仪记录小鼠步入、跳下的潜伏期和错误次数。结果 与相应时间点的正常组相比，Iso可减少小鼠自主活动次数，使避暗实验和跳台实验的步入和跳下潜伏期缩短、错误次数增加(P < 0.05）。Se（除8 mg·kg-1组在15min时外）对小鼠自主活动、步入和跳下潜伏期和错误次数无明显影响，但可增加Iso小鼠的自主活动次数,拮抗Iso对小鼠自主活动的影响；Se延长Iso小鼠的跳下和步入潜伏期,减少错误次数,改善Iso对幼小鼠学习记忆的影响(P < 0.05）。结论 Iso可降低幼小鼠自主活动次数，损害学习记忆能力，GABAA受体可能部分参与了以上作用。
关键词：异氟烷；自主活动；学习记忆；GABAA受体
学习和记忆是动物和人类赖以生存所不可缺少的脑功能，动物的自主活动情况反映其中枢神经系统的功能状态[1]。婴幼儿阶段是人脑发育成熟的关键时期，在此期间使用Iso是否无损中枢神经系统损伤尚无有力依据，有研究表明，异氟烷(isoflurane,Iso)可促进新生大鼠脑内广泛区域神经细胞凋亡,影响其成年后的学习记忆功能[2]，但异氟烷对于大于新生阶段的幼鼠自主活动和学习记
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30872432）；国家自然科学基金资助项目（30471657）；国家自然科学基金资助项目（39970715)
作者简介：张科学(1988-)，男；戴体俊(1944-)，男，教授，主要从事麻醉药理学研究
通讯作者：戴体俊，Tel:15150019359，Email:daitijun@
忆的影响国内外罕见报道。本实验以幼小鼠为实验对象，采用跳台和避暗法观察Iso对幼小鼠学习记忆作用，观察不同剂量Iso对小鼠自主活动计数的影响,并用能透过血脑屏障的GABAA受体特异性阻断剂一叶萩碱（securinine，Se）探讨其与GABAA受体关系，为临床合理选择麻醉方案提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
Iso由鲁南贝特制药有限公司生产，批号：080900；硝酸Se注射液由北京市永康药业有限公司生产，批号：090731，8 mg/2ml；YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪，安徽淮北正华生物仪器有限公司；DT2200跳台仪、BA2200小鼠避暗仪,成都泰盟科技有限公司产品。
1.2 动物及分组
昆明种幼小鼠360只，由徐州医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK(苏)2010-0003，9～10天龄,体质量8 ～13 g。实验前2 d使小鼠熟悉实验室环境，自由饮食、摄水，为避免小鼠各个时间段可能出现行为差异影响研究结果，实验于每日同一时间段进行。
每个实验的所有动物按分层随机区组设计分为正常对照组，Iso 0.05、0.1、0.2 ml·kg-1组，Se 2、4、8 mg·kg-1组，Iso 0.2 ml·kg-1+ Se 2、4、8 mg·kg-1组，每组分别sc给予相应剂量的生理盐水（正常对照）或Se，10min后ip给予Iso。
1.3 自主活动仪检测小鼠自主活动
记录仪测试用药后15 ，30 ，45 和60 min小鼠5 min内活动次数。
1.4 避暗实验
训练时,先将各组小鼠放入反应箱中,适应环境3 min,然后取出。向暗室底部铜栅通36V、50 Hz交流电,再将小鼠背对洞口放入明室,小鼠进入暗室则受到电击。24 h后重复实验,记录小鼠第1 次进入暗室的时间(步入潜伏期)和5 min内受到的电击次数(错误次数)。若小鼠5 min未进入暗室,错误次数记为0 次,潜伏期记为300 s。
1.5 跳台实验
各组小鼠放入反应箱内适应环境3 min,然后以36 V、50 Hz交流电给予电击。小鼠受电击,正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数小鼠可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击后又迅速跳回平台，如此训练5 min,24 h后重做测验。记录小鼠第1 次跳下平台的潜伏期和3 min内受到电击的次数(错误次数)。若小鼠3 min未跳下平台,错误次数记为0次,潜伏期记为180 s。
1.6 统计学处理
计量资料用均数±标准差（±S）表示，用SPSS 13.0软件进行统计学处理。组间比较采用非参数检验，α= 0.05为检验水准。
2 结果
2.1 异氟烷对幼小鼠自主活动的影响
表1结果显示，正常对照组小鼠的自主活动次数在4个测试时间点逐渐减少，60 min时5 min内的自主活动次数为45±35次。与相应时间点的各正常对照组相比，Iso 0.05、0.1和0.2 ml·kg-1组（除Iso 0.05在60 min时）小鼠自主活动次数均明显减少，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01）。Se 2和4 mg·kg-1对小鼠的自主活动次数无影响，但Se 8 mg·kg-1 在用药后15min小鼠自主活动次数明显减少，并有2只小鼠出现惊厥，差异有统计学意义(P < 0.05)。与各相应时间单用Iso 0.2 ml·kg-1组相比，Se 2，4和8 mg·kg-1在15 min时、Se 4 mg·kg-1在30 min时和Se 2 mg·kg-1在45 min时自主活动次数明显增加，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)；但与与各相应时间正常对照组比较，合用组Se 2 mg·kg-1在15 min、Se 4 mg·kg-1在15和60 min、Se 8 mg·kg-1在4个测试点时自主活动次数明显减少，差异有统计学意义(P < 0.01）。
表1. 异氟烷(Iso)对幼小鼠自主活动的影响
Tab 1 Effects of isoflurane（Iso）on spontaneous motor activity in juvenile mice
组别 自主活动次数
15 30 45 60(min )
正常对照 100±38 70±31 66±43 45±35
Iso 0.05 41±19* 19±12** 30±28* 29±27
0.1 15±14** 16±8** 14±12** 17±13*
0.2 6±3** 28±22** 30±21* 23±18*
Se 2 87±29 54±41 52±27 42±23
4 90±31 50±20 50±19 38±22
8 48±46* 63±37 46±20 46±24
Iso 0.2 +Se 2 24±28**# 58±48 55±37# 27±16
4 23±15**# 74±43## 39±23 17±15**
8 24±10**# 19±18** 22±20** 11±6**
sc给予生理盐水（正常对照）或Se，10min 后ip给予Iso，15min后测5min内活动次数。± s,n = 10.*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；# P<0.05，## P<0.01，与相应时间点的Iso 0.2组比较。
2.2 异氟烷对幼小鼠学习记忆的影响
表2结果显示，避暗实验中，与正常组相比,注药后1d，Iso 0.1、0.2 ml·kg-1组小鼠错误次数显著增加、潜伏期显著缩短，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)，Iso 0.05 ml·kg-1组错误次数显著增加，差异有统计学意义(P < 0.05)。Se 2、4、8 mg·kg-1组在注药后1d和2d，错误次数与潜伏期差异均无统计学意义（P > 0.05）。与各相应时间单用Iso 0.2 ml·kg-1组相比，注药后1d,Se 2、4、8 mg·kg-1组小鼠错误次数显著减少，潜伏期显著延长，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)；但与正常组比较，注药后1d和2d，合用组Se 2 mg·kg-1组潜伏期显著缩短，错误次数显著增加，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01）。
表2. 异氟烷(Iso)对幼小鼠学习记忆（避暗实验）的影响
Tab 2 Effects of isoflurane（Iso）and securinine（Se）on latency and errortimes in step through test in juvenile mice
组别 1d 2d
错误次数 潜伏期/s 错误次数 潜伏期/s
正常对照 1.0±0.5 128±68 0.6±0.5 241±97
Iso 0.05 2.3±1.4* 103±87 0.7±0.5 189±106
0.1 2.8±1.5* 27±13** 0.8±0.6 190±100
0.2 3.7±1.9** 30±16** 0.6±0.5 200±133
Se 2 0.9±0.7 156±101 0.7±0.6 224±71
4 0.7±0.5 176±93 0.6±0.5 237±57
8 0.6±0.5 183±108 0.7±0.6 231±63
Iso 0.2+Se 2 1.7±0.5*# 50±20**# 1.5±0.7*# 145±49*
4 0.6±0.5## 193±100## 0.3±0.5 251±80
8 0.7±0.5## 150±106## 0.3±0.5 271±57
sc给予生理盐水（正常对照）或Se，10min 后ip给予Iso，15min后测5min内活动次数。± s,n = 10.*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；# P<0.05，## P<0.01，与相应时间点的Iso 0.2组比较。
表3结果显示，在跳台实验中，与正常组相比,注药后1d，Iso 0.1、0.2ml·kg-1组小鼠错误次数显著增加、潜伏期显著缩短，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)；注药后1d和2d，Se 2、4、8 mg·kg-1组错误次数与潜伏期差异均无统计学意义（P > 0.05）；与各相应时间单用Iso 0.2 ml·kg-1组相比，注药后1d，合用组Se 4、8 mg·kg-1组小鼠错误次数显著减少、潜伏期显著延长，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），Se 2 mg·kg-1组小鼠错误次数显著减少(P < 0.05）。
表3. 异氟烷对幼小鼠学习记忆（跳台实验）的影响
Tab 3 Effects of isoflurane（Iso）and securinine（Se）on latency and errortimes in step dawn test in juvenile mice
组别 1d 2d
错误次数 潜伏期/s 错误次数 潜伏期/s
正常对照 0.7±0.5 143±70 0.5±0.5 141±64
Iso 0.05 1.4±1.0 76±59 0.8±0.9 106±80
0.1 1.7±0.7** 47±33* 0.3±0.5 160±37
0.2 2.5±1.1* 46±40* 0.5±1.0 160±48
Se 2 0.6±0.7 142±69 0.5±0.7 140±63
4 0.3±0.7 180±0 0.6±0.7 131±62
8 0.4±0.5 129±68 0.3±0.7 160±44
Iso 0.2+Se 2 0.6±0.7# 104±85 0.4±0.5 134±71
4 0.5±0.7# 149±48## 0.4±0.7 154±44
8 0.8±0.9# 127±71# 0.6±1.0 148±63
sc给予生理盐水（正常对照）或Se，10min 后ip给予Iso，15min后测5min内活动次数。± s,n = 10.*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；# P<0.05，## P<0.01，与相应时间点的Iso 0.2组比较。
3 讨论
本实验结果表明，Iso在用药后1d可降低幼小鼠自主活动次数，损害学习记忆能力，但2d后以上作用消失，可能是药物经过5个半衰期已被基本消除之故,提示Iso对于幼儿并未造成长期的神经损害。因此在临床患儿麻醉时，针对神经发育已经有异常的患儿，使用异氟烷麻醉应慎重选择。
目前普遍认为,Iso是通过多种机理发挥全麻作用的,其中GABAA受体被认为是Iso最重要的作用靶位[3,4]，在记忆的形成中主要发挥负性调节作用[5]。Se和荷包牡丹碱（bicuculline）为GABAA受体的竞争性拮抗剂,可减弱或阻断GABAA受体介导的抑制效应[6]，Se能够透过血脑屏障,故可采用sc给药，而荷包牡丹碱不易透过血脑屏障，故未采用。Se是大戟科植物叶底珠Securinega suffruticosa(Pall.)Rehd.嫩枝叶或根的主要生物碱[7]。该生物碱最早由原苏联学者从俄罗斯乌苏里地区植物中分离获得,但其化学结构却是由我国学者从本土资源提取分离并最终确定,作用机制研究方面,Beutler等[8]发现Se具有拮抗GABA受体的作用,对另一种中枢抑制性递质甘氨酸无影响,因此认为Se是哺乳类动物中枢神经元GABA受体识别部位的选择性拮抗剂，我国学者也证明了其与GABA受体呈现特异性结合,IC50为10-4mol·L-1[9]。
本实验中单独给予Se，小鼠未出现明显的活动异常和遗忘现象，但却明显改善了用Iso后小鼠的自主活动和记忆功能，提示激动GABAA受体,可能是Iso影响幼小鼠自主活动和学习记忆行为的重要机制之一，Iso可能通过激动GABAA受体而抑制突触传递的长时程增强效应,产生遗忘作用[6]和影响自主活动。许多离体实验的研究结果表明,吸入全麻药可增加GABAA受体介导的Cl-内流，Hall等[10]证实Iso可增强小鼠小脑蒲肯野神经元GABA激活的Cl-内流。Iso可能通过与GABAA受体结合后Cl-通道开放的频率增加，使神经细胞超极化，从而产生突触前和突触后抑制发挥其作用。Werner 等[11]等证实,吸入麻醉药的麻醉作用与GABAA受体有关，李程程[12]、王丹[13]等用icv注射荷包牡丹碱证实GABAA受体介导了全麻药丙泊酚、依托咪酯的损害学习记忆作用，本实验通过sc给予Se证实GABAA受体可能部分参与了Iso的损害幼小鼠学习记忆作用，与以上研究结论相一致。实验中单独sc 给予Se 8 mg.kg-1后15 min小鼠的自主活动次数减少，此效应可能与Se用量高引起强直性惊厥[14]有关，具体机制尚待进一步研究。
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Effects of isoflurane on spontaneous motor activity and learning behaviors in juvenile mice
ZHANG Ke-xue1, ZHAO Jia-jia1,ZHANG Qing-hua1,QUAN Quan1,WANG Xiao-jian1,LI Hua-chao1,LIN Jie-rong1,CAI Hui-ming1,LIU Su1, DAI Ti-jun2
（Xuzhou Medical College：1.School of Anesthesiology;2.Department of Anesthetic Pharmacology, Xuzhou, Jiangsu,China 221002)
Abstract: OBJECTIVE To investigate the effects of isoflurane on spontaneous motor activity,learning behaviors and their relationships with GABAA receptor in juvenile mice. METHODS 360 mice were divided into three big groups.Every big group was divided into NS group,Iso 0.05,0.1,0.2 ml·kg-1 groups,Se 2,4,8 mg·kg-1 groups, and Iso 0.2 ml·kg-1+Se 2、4 and 8mg·kg-1groups.NS and Se were given sc 25min before testing and Iso was given ip 10 min after it.Recording the times of spontaneous motor activity in 15,30,45,60 min after given Iso and the latency and errortimes of step dawn and step through test in 1d and 2d. RESULTS Compared with NS group,Iso can decrease the spontaneous motor activity times,and decrease the latency and increase the errortimes of step dawn and step through tests in juvenile mice.Se didn't effect the spontaneous motor activity times and the latency and the errortimes of step dawn and step through tests in juvenile mice. But Se can decrease the effect of Iso on spontaneous motor activity and the latency and errortimes of step dawn and step through tests in juvenile mice. CONCLUSION Isoflurane can decrease the spontaneous motor activity times in juvenile mice, it can also restrain learning and memory function in juvenile mice, and GABAA receptor is involved in above effects.
Key words: isoflurane ; spontaneous motor activity; learning behaviors;GABAA receptor
Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China(30872432); National Natural Science Foundation of China (30471657) ; Nati onal Natural Science Foundation of China (39970715)
Corresponding author: DAI Ti-jun, Tel:15150019359;E-mail:daitijun@(收起)
